PCR რეაქციებში ჩარევის ფაქტორები

PCR რეაქციის დროს ხშირად გვხვდება გარკვეული ხელისშემშლელი ფაქტორები.
PCR-ის ძალიან მაღალი მგრძნობელობის გამო, დაბინძურება PCR შედეგებზე მოქმედ ერთ-ერთ უმნიშვნელოვანეს ფაქტორად ითვლება და შეიძლება ცრუ დადებითი შედეგები გამოიწვიოს.
არანაკლებ კრიტიკულია სხვადასხვა წყარო, რომლებიც ცრუ-უარყოფით შედეგებს იწვევს. თუ PCR ნარევის ერთი ან მეტი მნიშვნელოვანი ნაწილი ან თავად ამპლიფიკაციის რეაქცია დათრგუნულია ან მასზე გავლენა არსებობს, დიაგნოსტიკური ანალიზი შეიძლება შეფერხდეს. ამან შეიძლება გამოიწვიოს ეფექტურობის შემცირება და ცრუ-უარყოფითი შედეგებიც კი.
ინჰიბირების გარდა, სამიზნე ნუკლეინის მჟავის მთლიანობის დაკარგვა შეიძლება მოხდეს ნიმუშის მომზადებამდე ტრანსპორტირების და/ან შენახვის პირობების გამო. კერძოდ, მაღალმა ტემპერატურამ ან არასაკმარისმა შენახვამ შეიძლება გამოიწვიოს უჯრედებისა და ნუკლეინის მჟავების დაზიანება. უჯრედებისა და ქსოვილების ფიქსაცია და პარაფინის ჩანერგვა დნმ-ის ფრაგმენტაციის ცნობილი მიზეზებია და მუდმივი პრობლემაა (იხილეთ სურათები 1 და 2). ამ შემთხვევებში, ოპტიმალური იზოლაცია და გაწმენდაც კი არ დაეხმარება.

სურათი 1 | იმობილიზაციის გავლენა დნმ-ის მთლიანობაზე
აგაროზული გელის ელექტროფორეზის გამოყენებით, აუტოფსიის პარაფინის სექციებიდან იზოლირებული დნმ-ის ხარისხი მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდა. ექსტრაქტებში ფიქსაციის მეთოდის მიხედვით, სხვადასხვა საშუალო ფრაგმენტის სიგრძის დნმ იყო წარმოდგენილი. დნმ შენარჩუნდა მხოლოდ მაშინ, როდესაც ფიქსირდებოდა ბუნებრივ გაყინულ ნიმუშებში და ბუფერულ ნეიტრალურ ფორმალინში. ძლიერ მჟავე ბუენის ფიქსატორის ან არაბუფერული, ჭიანჭველმჟავას შემცველი ფორმალინის გამოყენებამ დნმ-ის მნიშვნელოვანი დანაკარგი გამოიწვია. დარჩენილი ფრაქცია ძლიერ ფრაგმენტირებულია.
მარცხნივ, ფრაგმენტების სიგრძე გამოხატულია კილობაზას წყვილებში (kbp)

სურათი 2 | ნუკლეინის მჟავის სამიზნეების მთლიანობის დაკარგვა
(ა) ორივე ჯაჭვზე 3′-5′ უფსკრული გამოიწვევს სამიზნე დნმ-ის გაწყვეტას. დნმ-ის სინთეზი მაინც მოხდება მცირე ფრაგმენტზე. თუმცა, თუ დნმ-ის ფრაგმენტზე პრაიმერის გახურების ადგილი აკლია, ხდება მხოლოდ წრფივი ამპლიფიკაცია. ყველაზე ხელსაყრელ შემთხვევაში, ფრაგმენტებმა შეიძლება ხელახლა გაჯერონ ერთმანეთი, მაგრამ მოსავლიანობა მცირე იქნება და აღმოჩენის დონეებზე დაბალი.
(ბ) ფუძეების დაკარგვა, ძირითადად დეპურინაციისა და თიმიდინის დიმერის წარმოქმნის გამო, იწვევს H-ბმების რაოდენობის შემცირებას და Tm-ის შემცირებას. გახანგრძლივებული დათბობის ფაზის დროს, პრაიმერები დნება მატრიქსული დნმ-დან და არ გახურდება ნაკლებად მკაცრ პირობებშიც კი.
(გ) მიმდებარე თიმინის ფუძეები ქმნიან TT დიმერს.
კიდევ ერთი გავრცელებული პრობლემა, რომელიც ხშირად გვხვდება მოლეკულურ დიაგნოსტიკაში, არის სამიზნე ნუკლეინის მჟავების ნაკლებად ოპტიმალურზე ნაკლები გამოთავისუფლება ფენოლ-ქლოროფორმის ექსტრაქციასთან შედარებით. უკიდურეს შემთხვევაში, ეს შეიძლება დაკავშირებული იყოს ცრუ უარყოფით შედეგებთან. უჯრედული ნარჩენების დუღილის ლიზისით ან ფერმენტული დაშლით შეიძლება დიდი დროის დაზოგვა, მაგრამ ეს მეთოდი ხშირად იწვევს დაბალ PCR მგრძნობელობას ნუკლეინის მჟავის არასაკმარისი გამოთავისუფლების გამო.

პოლიმერაზული აქტივობის ინჰიბირება ამპლიფიკაციის დროს

ზოგადად, ინჰიბირება გამოიყენება როგორც კონტეინერის კონცეფცია, რათა აღიწეროს ყველა ის ფაქტორი, რომელიც იწვევს სუბოპტიმალურ PCR შედეგებს. მკაცრად ბიოქიმიური გაგებით, ინჰიბირება შემოიფარგლება ფერმენტის აქტივობით, ანუ ის ამცირებს ან ხელს უშლის სუბსტრატ-პროდუქტის გარდაქმნას დნმ პოლიმერაზას აქტიურ ცენტრთან ან მის კოფაქტორთან ურთიერთქმედების გზით (მაგ., Mg2+ Taq დნმ პოლიმერაზასთვის).
ნიმუშში შემავალი კომპონენტები ან რეაგენტების შემცველი სხვადასხვა ბუფერები და ექსტრაქტები პირდაპირ აინჰიბირებენ ფერმენტს ან აკავებენ მის კოფაქტორებს (მაგ. EDTA), რითაც ინაქტივირებენ პოლიმერაზას და, თავის მხრივ, იწვევენ PCR შედეგების შემცირებას ან ცრუ უარყოფით შედეგს.
თუმცა, რეაქციის კომპონენტებსა და სამიზნის შემცველ ნუკლეინის მჟავებს შორის მრავალი ურთიერთქმედება ასევე „პჯრ ინჰიბიტორებად“ არის მოხსენიებული. მას შემდეგ, რაც იზოლაციით უჯრედის მთლიანობა ირღვევა და ნუკლეინის მჟავა გამოიყოფა, შეიძლება მოხდეს ურთიერთქმედება ნიმუშსა და მის გარშემო არსებულ ხსნარსა და მყარ ფაზას შორის. მაგალითად, „მაწმენდებს“ შეუძლიათ დაუკავშირდნენ ერთ ან ორჯაჭვიან დნმ-ს არაკოვალენტური ურთიერთქმედებების გზით და ხელი შეუშალონ იზოლაციასა და გაწმენდას იმ სამიზნეების რაოდენობის შემცირებით, რომლებიც საბოლოოდ აღწევენ პოლიმერაზული ჯაჭვის რეაქციის ჭურჭელში.
ზოგადად, PCR ინჰიბიტორები გვხვდება კლინიკური დიაგნოსტიკური ტესტებისთვის გამოყენებული ორგანიზმის სითხეებისა და რეაგენტების უმეტესობაში (შარდოვანა შარდში, ჰემოგლობინი და ჰეპარინი სისხლში), საკვებ დანამატებში (ორგანული კომპონენტები, გლიკოგენი, ცხიმი, Ca2+ იონები) და გარემოში არსებულ კომპონენტებში (ფენოლები, მძიმე მეტალები).

უფრო გავრცელებული PCR ინჰიბიტორები გვხვდება ბაქტერიებსა და ეუკარიოტულ უჯრედებში, არასამიზნე დნმ-ში, ქსოვილოვანი მატრიცების დნმ-შემაკავშირებელ მაკრომოლეკულებში და ლაბორატორიულ აღჭურვილობაში, როგორიცაა ხელთათმანები და პლასტმასი. ნუკლეინის მჟავების გაწმენდა ექსტრაქციის დროს ან მის შემდეგ PCR ინჰიბიტორების მოსაშორებლად სასურველი მეთოდია.
დღესდღეობით, სხვადასხვა ავტომატიზირებული ექსტრაქციის მოწყობილობას შეუძლია მრავალი ხელით ჩატარებული პროტოკოლის ჩანაცვლება, თუმცა სამიზნეების 100%-იანი აღდგენა და/ან გაწმენდა არასდროს მიღწეულა. პოტენციური ინჰიბიტორები შეიძლება კვლავ იმყოფებოდეს გაწმენდილ ნუკლეინის მჟავებში ან უკვე ამოქმედდეს. ინჰიბიტორების ზემოქმედების შესამცირებლად არსებობს სხვადასხვა სტრატეგია. შესაბამისი პოლიმერაზას არჩევანს შეიძლება მნიშვნელოვანი გავლენა ჰქონდეს ინჰიბიტორის აქტივობაზე. PCR ინჰიბირების შესამცირებლად სხვა დადასტურებული მეთოდებია პოლიმერაზას კონცენტრაციის გაზრდა ან დანამატების, როგორიცაა BSA, გამოყენება.
PCR რეაქციების ინჰიბირება შეიძლება დემონსტრირებული იყოს შიდა პროცესის ხარისხის კონტროლის (IPC) გამოყენებით.
ექსტრაქციის ნაკრებში არსებული ყველა რეაგენტისა და სხვა ხსნარის, როგორიცაა ეთანოლი, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, იზოპროპანოლი და ფენოლი, ამოღება ნუკლეინის მჟავას იზოლატიდან საფუძვლიანი გარეცხვის ეტაპით უნდა მოხდეს სიფრთხილით. მათი კონცენტრაციიდან გამომდინარე, მათ შეუძლიათ გაააქტიურონ ან დათრგუნონ PCR.