ჩარევის ფაქტორები PCR რეაქციებში

PCR რეაქციის დროს ხშირად ხვდება ზოგიერთი შემაფერხებელი ფაქტორი.
PCR-ის ძალიან მაღალი მგრძნობელობის გამო, დაბინძურება ითვლება ერთ-ერთ ყველაზე მნიშვნელოვან ფაქტორად, რომელიც გავლენას ახდენს PCR შედეგებზე და შეიძლება გამოიწვიოს ცრუ დადებითი შედეგები.
თანაბრად კრიტიკულია სხვადასხვა წყაროები, რომლებიც იწვევს ცრუ-უარყოფით შედეგებს. თუ PCR ნარევის ერთი ან მეტი არსებითი ნაწილი ან თავად ამპლიფიკაციის რეაქცია დათრგუნულია ან შეფერხებულია, დიაგნოსტიკური ანალიზი შეიძლება შეფერხდეს. ამან შეიძლება გამოიწვიოს ეფექტურობის შემცირება და ცრუ უარყოფითი შედეგებიც კი.
ინჰიბირების გარდა, სამიზნე ნუკლეინის მჟავას მთლიანობის დაკარგვა შეიძლება მოხდეს მიწოდების ან/და შენახვის პირობების გამო ნიმუშის მომზადებამდე. კერძოდ, მაღალმა ტემპერატურამ ან არაადეკვატურმა შენახვამ შეიძლება გამოიწვიოს უჯრედების და ნუკლეინის მჟავების დაზიანება. უჯრედისა და ქსოვილის ფიქსაცია და პარაფინის ჩანერგვა დნმ-ის ფრაგმენტაციის ცნობილი მიზეზებია და მუდმივი პრობლემაა (იხ. ნახატები 1 და 2). ამ შემთხვევებში ოპტიმალური იზოლაცია და გაწმენდაც კი არ დაეხმარება.

სურათი 1 | იმობილიზაციის ეფექტი დნმ-ის მთლიანობაზე
აგაროზის გელის ელექტროფორეზიმ აჩვენა, რომ გაკვეთის პარაფინის სექციებიდან გამოყოფილი დნმ-ის ხარისხი მნიშვნელოვნად იცვლებოდა. დნმ სხვადასხვა საშუალო სიგრძის ფრაგმენტები იყო წარმოდგენილი ექსტრაქტებში ფიქსაციის მეთოდის მიხედვით. დნმ შენარჩუნებული იყო მხოლოდ გაყინულ ნიმუშებში და ბუფერულ ნეიტრალურ ფორმალინში დაფიქსირებისას. ძლიერ მჟავე ბუინის ფიქსატორის ან არაბუფერული, ჭიანჭველა მჟავას შემცველი ფორმალინის გამოყენებამ გამოიწვია დნმ-ის მნიშვნელოვანი დაკარგვა. დარჩენილი ფრაქცია ძლიერ ფრაგმენტულია.
მარცხნივ, ფრაგმენტების სიგრძე გამოიხატება კილობაზის წყვილებში (კბპ)

სურათი 2 | ნუკლეინის მჟავის სამიზნეების მთლიანობის დაკარგვა
(ა) 3'-5' უფსკრული ორივე ჯაჭვზე გამოიწვევს სამიზნე დნმ-ის რღვევას. დნმ-ის სინთეზი კვლავ მოხდება მცირე ფრაგმენტზე. თუმცა, თუ დნმ-ის ფრაგმენტზე პრაიმერის ანეილირების ადგილი აკლია, მხოლოდ წრფივი გაძლიერება ხდება. ყველაზე ხელსაყრელ შემთხვევაში, ფრაგმენტებმა შეიძლება გააჯერონ ერთმანეთი, მაგრამ მოსავლიანობა იქნება მცირე და დაბალი აღმოჩენის დონეზე.
ბ) ფუძეების დაკარგვა, ძირითადად დეპურინაციით და თიმიდინის დიმერის წარმოქმნით, იწვევს H- ბმების რაოდენობის შემცირებას და Tm-ის შემცირებას. გახანგრძლივებული დათბობის ფაზაში, პრაიმერები დნება მატრიცის დნმ-ს და არ ანეირდება ნაკლებად მკაცრ პირობებშიც კი.
(გ) მიმდებარე თიმინური ფუძეები ქმნიან TT დიმერს.
კიდევ ერთი გავრცელებული პრობლემა, რომელიც ხშირად გვხვდება მოლეკულურ დიაგნოსტიკაში, არის სამიზნე ნუკლეინის მჟავების ოპტიმალური გამოყოფა ფენოლ-ქლოროფორმის ექსტრაქციასთან შედარებით. უკიდურეს შემთხვევაში, ეს შეიძლება ასოცირებული იყოს ცრუ ნეგატივთან. ბევრი დრო შეიძლება დაზოგოს უჯრედის ნამსხვრევების დუღილის ლიზისით ან ფერმენტული მონელებით, მაგრამ ეს მეთოდი ხშირად იწვევს დაბალ PCR მგრძნობელობას ნუკლეინის მჟავას არასაკმარისი გამოყოფის გამო.

პოლიმერაზას აქტივობის დათრგუნვა ამპლიფიკაციის დროს

ზოგადად, დათრგუნვა გამოიყენება როგორც კონტეინერის კონცეფცია ყველა ფაქტორის აღსაწერად, რომელიც იწვევს არაოპტიმალურ PCR შედეგებს. მკაცრად ბიოქიმიური გაგებით, დათრგუნვა შემოიფარგლება ფერმენტის აქტივობით, ანუ ამცირებს ან აფერხებს სუბსტრატ-პროდუქტის კონვერტაციას დნმ პოლიმერაზას ან მის კოფაქტორთან (მაგ., Mg2+ Taq დნმ პოლიმერაზას) აქტიურ ადგილთან ურთიერთქმედების გზით.
ნიმუშში შემავალ კომპონენტებს ან სხვადასხვა ბუფერებსა და ექსტრაქტებს, რომლებიც შეიცავს რეაგენტებს, შეუძლიათ პირდაპირ დათრგუნონ ფერმენტი ან დაამახინჯონ მისი კოფაქტორები (მაგ. EDTA), რითაც ინაქტივირებენ პოლიმერაზას და, თავის მხრივ, იწვევს PCR შედეგების შემცირებას ან ცრუ უარყოფით შედეგებს.
თუმცა, მრავალი ურთიერთქმედება რეაქციის კომპონენტებსა და სამიზნე შემცველ ნუკლეინის მჟავებს შორის ასევე დასახელებულია როგორც "PCR ინჰიბიტორები". მას შემდეგ, რაც უჯრედის მთლიანობა ირღვევა იზოლაციით და ნუკლეინის მჟავა გამოიყოფა, შეიძლება მოხდეს ურთიერთქმედება ნიმუშსა და მის მიმდებარე ხსნარსა და მყარ ფაზას შორის. მაგალითად, „გამწმენდებს“ შეუძლიათ ერთჯერადი ან ორჯაჭვიანი დნმ-ის შეკვრა არაკოვალენტური ურთიერთქმედების გზით და ხელი შეუშალონ იზოლაციასა და გაწმენდას იმ სამიზნეების რაოდენობის შემცირებით, რომლებიც საბოლოოდ მიაღწევენ PCR რეაქციის ჭურჭელს.
ზოგადად, PCR ინჰიბიტორები წარმოდგენილია სხეულის სითხეებსა და რეაგენტებში, რომლებიც გამოიყენება კლინიკურ დიაგნოსტიკური ტესტებისთვის (შარდოვანა შარდში, ჰემოგლობინი და ჰეპარინი სისხლში), დიეტური დანამატები (ორგანული კომპონენტები, გლიკოგენი, ცხიმი, Ca2+ იონები) და გარემოში არსებული კომპონენტები (ფენოლი). მძიმე ლითონები)

უფრო გავრცელებული PCR ინჰიბიტორები გვხვდება ბაქტერიებსა და ეუკარიოტულ უჯრედებში, არასამიზნე დნმ-ში, ქსოვილის მატრიცების დნმ-ის შემაკავშირებელ მაკრომოლეკულებში და ლაბორატორიულ აღჭურვილობაში, როგორიცაა ხელთათმანები და პლასტმასი. ნუკლეინის მჟავების გაწმენდა ექსტრაქციის დროს ან მის შემდეგ არის PCR ინჰიბიტორების მოსაშორებლად სასურველი მეთოდი.
დღეს, სხვადასხვა ავტომატიზირებულ მოპოვების მოწყობილობას შეუძლია შეცვალოს მრავალი ხელით პროტოკოლი, მაგრამ სამიზნეების 100% აღდგენა და/ან გაწმენდა არასოდეს ყოფილა მიღწეული. პოტენციური ინჰიბიტორები შესაძლოა კვლავ იყოს წარმოდგენილი გასუფთავებულ ნუკლეინის მჟავებში ან უკვე მოქმედებდნენ. არსებობს სხვადასხვა სტრატეგია ინჰიბიტორების ზემოქმედების შესამცირებლად. შესაბამისი პოლიმერაზას არჩევამ შეიძლება მნიშვნელოვანი გავლენა იქონიოს ინჰიბიტორების აქტივობაზე. სხვა დადასტურებული მეთოდები PCR ინჰიბირების შესამცირებლად არის პოლიმერაზას კონცენტრაციის გაზრდა ან დანამატების გამოყენება, როგორიცაა BSA.
PCR რეაქციების დათრგუნვა შეიძლება გამოვლინდეს შიდა პროცესის ხარისხის კონტროლის (IPC) გამოყენებით.
სიფრთხილეა საჭირო, რათა ამოიღონ ყველა რეაგენტი და სხვა ხსნარი ექსტრაქციის კომპლექტში, როგორიცაა ეთანოლი, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, იზოპროპანოლი და ფენოლი, ნუკლეინის მჟავას იზოლატიდან საფუძვლიანი გარეცხვის საფეხურით. მათი კონცენტრაციიდან გამომდინარე, მათ შეუძლიათ გაააქტიურონ ან დათრგუნონ PCR.