ჩარევის ფაქტორები PCR რეაქციებში

PCR რეაქციის დროს, ხშირად ჩარევის ფაქტორს ხშირად გვხვდება.
PCR– ის ძალიან მაღალი მგრძნობელობის გამო, დაბინძურება ითვლება ერთ - ერთ ყველაზე მნიშვნელოვან ფაქტორად, რომელიც გავლენას ახდენს PCR– ს შედეგებზე და შეუძლია ცრუ დადებითი შედეგების წარმოქმნა.
თანაბრად კრიტიკულია სხვადასხვა წყარო, რომელიც იწვევს ცრუ-უარყოფითი შედეგების მიღწევას. თუ PCR ნარევის ერთი ან მეტი აუცილებელი ნაწილი ან ამპლიფიკაციის რეაქცია თავისთავად შეფერხებულია ან ერევა, დიაგნოსტიკური გამოკვლევა შეიძლება შეფერხდეს. ამან შეიძლება გამოიწვიოს ეფექტურობის შემცირება და ცრუ უარყოფითი შედეგებიც კი.
ინჰიბირების გარდა, სამიზნე ნუკლეინის მჟავას მთლიანობის დაკარგვა შეიძლება მოხდეს გადაზიდვის ან/და შენახვის პირობების გამო, ნიმუშის მომზადებამდე. კერძოდ, მაღალმა ტემპერატურამ ან არაადეკვატურმა შენახვამ შეიძლება გამოიწვიოს უჯრედების და ნუკლეინის მჟავების დაზიანება. უჯრედისა და ქსოვილების ფიქსაცია და პარაფინის ჩანერგვა კარგად არის ცნობილი დნმ -ის ფრაგმენტაციის და მუდმივი პრობლემა (იხ. ნახ. 1 და 2). ამ შემთხვევებში, ოპტიმალური იზოლაცია და გაწმენდის თუნდაც არ დაგვეხმარება.

სურათი 1 | იმობილიზაციის ეფექტი დნმ -ის მთლიანობაზე
აგაროს გელის ელექტროფორეზი აჩვენა, რომ გაკვეთილების პარაფინის სექციებიდან იზოლირებული დნმ -ის ხარისხი მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდა. სხვადასხვა ფრაგმენტის სიგრძის დნმ იყო ექსტრაქტებში, ფიქსაციის მეთოდიდან გამომდინარე. დნმ შენარჩუნდა მხოლოდ მაშინ, როდესაც დაფიქსირდა მშობლიური გაყინული ნიმუშები და ბუფერული ნეიტრალური ფორმალინი. ძლიერად მჟავე ბუინის ფიქსაციური ან გაუგებარი, ფორმალური მჟავას შემცველი ფორმალინის გამოყენებამ გამოიწვია დნმ-ის მნიშვნელოვანი დანაკარგი. დარჩენილი ფრაქცია ძალიან ფრაგმენტულია.
მარცხენა მხარეს, ფრაგმენტების სიგრძე გამოიხატება კილოვაზის წყვილებში (KBP)

სურათი 2 | ნუკლეინის მჟავების სამიზნეების მთლიანობის დაკარგვა
(ა) ორივე ზოლზე 3′-5 ′ უფსკრული გამოიწვევს სამიზნე დნმ-ს შესვენებას. დნმ -ის სინთეზი კვლავ მოხდება მცირე ფრაგმენტზე. ამასთან, თუ დნმ -ის ფრაგმენტზე პრაიმერის annealing საიტი აკლია, ხდება მხოლოდ ხაზოვანი გამაძლიერებელი. ყველაზე ხელსაყრელ შემთხვევაში, ფრაგმენტებმა შეიძლება ერთმანეთის განზომილება მოახდინონ, მაგრამ მოსავლიანობა მცირე და გამოვლენის დონის ქვემოთ იქნება.
(ბ) ბაზების დაკარგვა, ძირითადად, დეპურაციისა და თიმიდინის დიმერის წარმოქმნის გამო, იწვევს H- ობლიგაციების რაოდენობის შემცირებას და TM- ის შემცირებას. წაგრძელებული დათბობის ფაზის დროს, პრაიმერები მოშორდებიან მატრიქსის დნმ -ს და არ იბანენენ თუნდაც ნაკლებ მკაცრ პირობებში.
(გ) მიმდებარე თიმინის ბაზები ქმნიან TT დიმერს.
კიდევ ერთი გავრცელებული პრობლემა, რომელიც ხშირად გვხვდება მოლეკულურ დიაგნოზში, არის სამიზნე ნუკლეინის მჟავების ნაკლებად ოპტიმალური განთავისუფლება ფენოლ-ქლოროფორმის მოპოვებასთან შედარებით. ექსტრემალურ შემთხვევებში, ეს შეიძლება ასოცირებული იყოს ცრუ ნეგატივებთან. დიდი დრო შეიძლება დაზოგოთ უჯრედების ნამსხვრევების ლიზით ან ფერმენტული მონელებით, მაგრამ ეს მეთოდი ხშირად იწვევს PCR– ს დაბალი მგრძნობელობას, არასაკმარისი ნუკლეინის მჟავას გამოყოფის გამო.

ამპლიფიკაციის დროს პოლიმერაზული მოქმედების ინჰიბირება

ზოგადად, ინჰიბიცია გამოიყენება, როგორც კონტეინერის კონცეფცია, რათა აღვწეროთ ყველა ფაქტორი, რაც იწვევს PCR- ს სუბპოპტიმალურ შედეგებს. მკაცრად ბიოქიმიური გაგებით, ინჰიბიცია შემოიფარგლება მხოლოდ ფერმენტის მოქმედებით, ანუ, იგი ამცირებს ან ხელს უშლის სუბსტრატ-პროდუქტის კონვერტაციას დნმ პოლიმერაზის ან მისი კოფაქტორთან აქტიური ადგილის ურთიერთქმედების გზით (მაგ., Mg2+ TAQ დნმ პოლიმერაზისთვის).
ნიმუშის კომპონენტებს ან სხვადასხვა ბუფერებსა და ექსტრაქტებს, რომლებიც შეიცავს რეაგენტებს, შეუძლიათ პირდაპირ შეაჩერონ ფერმენტი ან ხაფანგში მისი კოფაქტორები (მაგ. EDTA), რითაც პოლიმერაზის ინაქტივირება და, თავის მხრივ, იწვევს PCR– ს და ცრუ უარყოფითი შედეგების შემცირებას.
ამასთან, მრავალი ურთიერთქმედება რეაქციის კომპონენტებსა და სამიზნე შემცველ ნუკლეინის მჟავებს შორის ასევე არის მითითებული, როგორც "PCR ინჰიბიტორები". მას შემდეგ, რაც უჯრედის მთლიანობა შეფერხებულია იზოლაციით და ნუკლეინის მჟავა გაათავისუფლეს, შეიძლება მოხდეს ურთიერთქმედება ნიმუშსა და მის მიმდებარე ხსნარსა და მყარი ფაზას შორის. მაგალითად, 'scavengers' შეიძლება დააკავშიროს ერთჯერადი ან ორმაგი დნმ-ის დნმ-ს არა-კოვალენტური ურთიერთქმედების გზით და ჩაერიოს იზოლაცია და გაწმენდის გზით, სამიზნეების რაოდენობის შემცირებით, რომლებიც საბოლოოდ აღწევს PCR რეაქციის გემს.
ზოგადად, PCR ინჰიბიტორები გვხვდება სხეულის სითხეებში და რეაგენტებში, რომლებიც გამოიყენება კლინიკური დიაგნოსტიკური ტესტებისთვის (შარდში, შარდში, ჰემოგლობინი და სისხლში ჰეპარინი), დიეტური დანამატები (ორგანული კომპონენტები, გლიკოგენი, ცხიმი, Ca2+ იონები) და კომპონენტები გარემოში (ფენოლები, მძიმე მეტალები), კომპონენტები (ფენოლები, მძიმე მეტალები)

უფრო გავრცელებული PCR ინჰიბიტორები გვხვდება ბაქტერიებსა და ევკარიოტურ უჯრედებში, არა სამიზნე დნმ, დნმ-დამაკავშირებელი მაკრომოლეკულები ქსოვილების მატრიცებისა და ლაბორატორიული აღჭურვილობის, როგორიცაა ხელთათმანები და პლასტმასები. ნუკლეინის მჟავების გაწმენდა მოპოვების დროს ან მის შემდეგ, სასურველი მეთოდია PCR ინჰიბიტორების მოსაშორებლად.
დღეს, სხვადასხვა ავტომატიზირებული მოპოვების მოწყობილობას შეუძლია შეცვალოს მრავალი სახელმძღვანელო პროტოკოლი, მაგრამ 100% -იანი აღდგენა ან/და სამიზნეების გაწმენდა არასოდეს მიღწეულია. პოტენციური ინჰიბიტორები შეიძლება კვლავ იყოს წარმოდგენილი გაწმენდილი ნუკლეინის მჟავებში ან შეიძლება უკვე ამოქმედდეს. არსებობს სხვადასხვა სტრატეგია ინჰიბიტორების გავლენის შესამცირებლად. შესაბამისი პოლიმერაზის არჩევანს შეუძლია მნიშვნელოვანი გავლენა მოახდინოს ინჰიბიტორულ მოქმედებაზე. PCR ინჰიბიციის შემცირების სხვა დადასტურებული მეთოდები იზრდება პოლიმერაზის კონცენტრაცია ან ისეთი დანამატების გამოყენება, როგორიცაა BSA.
PCR რეაქციების ინჰიბიცია შეიძლება გამოვლინდეს შიდა პროცესის ხარისხის კონტროლის (IPC) გამოყენებით.
სიფრთხილით უნდა იქნას მიღებული მოპოვების ნაკრებში ყველა რეაგენტი და სხვა გადაწყვეტილებები, მაგალითად, ეთანოლი, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, იზოპროპანოლი და ფენოლი, ნუკლეინის მჟავას იზოლირებულიდან საფუძვლიანი სარეცხი ნაბიჯით. მათი კონცენტრაციიდან გამომდინარე, მათ შეუძლიათ გაააქტიურონ ან შეაჩერონ PCR.